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實時熒光定量PCR試劑盒的常見問題及解決策略
點擊次數(shù):660 更新時間:2024-06-25
  實時熒光定量PCR(Quantitative Real-Time PCR,簡稱qRT-PCR)技術(shù),因其高靈敏度、高特異性和高定量準(zhǔn)確性,已成為分子生物學(xué)研究中不可少的工具。然而,在實際使用過程中,實時熒光定量PCR試劑盒經(jīng)常會遇到一些常見問題,影響了實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。本文將對這些問題進(jìn)行梳理,并提出相應(yīng)的解決策略。
  一、常見問題
  1.無CT值(信號)出現(xiàn)
  無CT值出現(xiàn)是qRT-PCR實驗中最為常見的問題之一??赡艿脑虬ǎ悍磻?yīng)循環(huán)數(shù)不足、檢測熒光信號的步驟有誤、引物或探針降解、引物或探針設(shè)計不合理、模板量不足或模板降解等。
  2.CT值出現(xiàn)過晚
  CT值出現(xiàn)過晚通常意味著PCR擴(kuò)增效率較低。可能的原因包括:擴(kuò)增效率低、PCR反應(yīng)過程中退火及延伸的時間過短或過長、MgCl2濃度不合適、循環(huán)數(shù)設(shè)置不足、引物或探針設(shè)計有誤等。
  3.標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系不佳
  標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系不佳通常意味著PCR反應(yīng)中存在不穩(wěn)定因素,影響了實驗結(jié)果的定量準(zhǔn)確性??赡艿脑虬ǎ杭訕哟嬖谡`差、標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解等。
  二、解決策略
  1.針對無CT值出現(xiàn)的解決策略
  (1)確保反應(yīng)循環(huán)數(shù)足夠。一般而言,循環(huán)數(shù)應(yīng)設(shè)置在35至45個之間,避免背景信號過高影響結(jié)果。
 ?。?)檢查熒光信號檢測步驟是否正確。根據(jù)試劑盒說明書或?qū)嶒灧椒ǎ_保在正確的PCR反應(yīng)步驟中采集熒光信號。
  (3)通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解。若發(fā)現(xiàn)降解現(xiàn)象,應(yīng)重新制備引物和探針。
 ?。?)優(yōu)化引物和探針的設(shè)計。根據(jù)目的基因的特性,設(shè)計合適的引物和探針,避免引物跨越內(nèi)含子或探針設(shè)計在擴(kuò)增片段的5'端等可能導(dǎo)致擴(kuò)增效率低的問題。
 ?。?)確保模板量足夠且未降解。對于未知濃度的樣品,應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起,避免模板量不足導(dǎo)致無CT值出現(xiàn)。同時,注意樣品的儲存條件,避免反復(fù)凍融導(dǎo)致模板降解。
  2.針對CT值出現(xiàn)過晚的解決策略
 ?。?)優(yōu)化PCR反應(yīng)條件。如適當(dāng)降低退火溫度、調(diào)整延伸時間等,以提高PCR擴(kuò)增效率。
 ?。?)檢查MgCl2濃度是否合適。按0.5mM的間距調(diào)整MgCl2的濃度,找到適合本實驗條件的濃度。
 ?。?)重新設(shè)計引物和探針。若引物或探針設(shè)計不合理,可能導(dǎo)致擴(kuò)增效率低,應(yīng)重新設(shè)計并優(yōu)化。
 ?。?)確保PCR產(chǎn)物長度合適。PCR產(chǎn)物長度一般應(yīng)在80至150bp之間,過長或過短都可能影響擴(kuò)增效率。
  3.針對標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳的解決策略
  (1)確保加樣準(zhǔn)確。注意每次加樣的一致性及移液器的校正,避免加樣誤差導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳。
 ?。?)確保標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量穩(wěn)定。避免標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融或長時間儲存導(dǎo)致降解,應(yīng)重新制備并稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。
  實時熒光定量PCR試劑盒在使用過程中可能會遇到各種問題,但通過仔細(xì)排查原因并采取相應(yīng)的解決策略,可以確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

 

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