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如何使用熒光定量RT-PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)
點(diǎn)擊次數(shù)：1219 更新時(shí)間：2024-08-19
使用熒光定量RT-PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)是一個(gè)復(fù)雜但精確的過(guò)程，涉及多個(gè)關(guān)鍵步驟。以下是一個(gè)詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)流程，旨在指導(dǎo)如何正確使用該試劑盒進(jìn)行RNA的檢測(cè)和定量分析。
一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
1.了解試劑盒信息：首先，仔細(xì)閱讀試劑盒的說(shuō)明書(shū)，了解試劑盒的組成、儲(chǔ)存條件、有效期以及實(shí)驗(yàn)所需的設(shè)備和試劑。
2.實(shí)驗(yàn)設(shè)備和試劑準(zhǔn)備：
-熒光定量PCR儀：確保儀器已經(jīng)過(guò)校準(zhǔn)，并熟悉其操作界面。
-微量移液器、離心機(jī)、渦旋振蕩器、分光光度計(jì)等實(shí)驗(yàn)設(shè)備。
-無(wú)RNA酶的離心管、槍頭、EP管等耗材。
-試劑包括RNA提取試劑（如RNAiso Plus）、氯仿、異丙醇、75%乙醇（DEPC水配制）、反轉(zhuǎn)錄試劑、qPCR反應(yīng)液等。
二、實(shí)驗(yàn)步驟
1.細(xì)胞總RNA提取
1.細(xì)胞裂解：對(duì)于貼壁細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液后，用PBS清洗一次，加入適量RNA提取試劑（如RNAiso Plus），吹打均勻后室溫靜置5分鐘。
2.兩相分離：加入適量的氯仿（如每1ml RNAiso Plus加入200μl氯仿），劇烈振蕩后室溫靜置5分鐘，然后4℃離心15分鐘（12000G）。此時(shí)，混合物將分為三層，RNA主要在水相上層。
3.RNA沉淀：小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的無(wú)RNA酶離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后室溫靜置10分鐘，再4℃離心10分鐘（12000G）。此時(shí)，RNA將在管底部形成膠狀沉淀。
4.RNA清洗：棄去上清，加入適量的75%乙醇（用DEPC水配制），輕輕上下顛倒混勻，4℃離心5分鐘（7000rpm），重復(fù)清洗1-2次。
5.RNA干燥與溶解：小心吸去乙醇，室溫干燥RNA沉淀5-10分鐘，避免過(guò)分干燥。然后加入適量的無(wú)RNA酶水溶解RNA，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/span>
2.RNA濃度和純度測(cè)定
使用分光光度計(jì)測(cè)定RNA溶液在260nm和280nm處的吸光度值，計(jì)算RNA的濃度和純度（A260/A280比值應(yīng)接近2.0）。
3.反轉(zhuǎn)錄合成cDNA
根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明書(shū)，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。這通常涉及在RNA溶液中加入反轉(zhuǎn)錄酶、引物和其他必要組分，然后在適當(dāng)?shù)臏囟认路跤欢螘r(shí)間。
4.qPCR實(shí)驗(yàn)
1.配置qPCR反應(yīng)液：按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，將qPCR反應(yīng)液的各組分按比例混合，并加入適量的cDNA模板。
2.點(diǎn)板：將配置好的qPCR反應(yīng)液加入96孔板或八聯(lián)管中，注意避免氣泡和液滴貼壁。
3.上機(jī)檢測(cè)：將加好樣的孔板或八聯(lián)管放入熒光定量PCR儀中，設(shè)置合適的反應(yīng)條件（如溫度循環(huán)和熒光信號(hào)采集模式），開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。
4.數(shù)據(jù)分析：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，收集并分析熒光信號(hào)數(shù)據(jù)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線或CT值計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。
三、注意事項(xiàng)
1.避免污染：整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格遵循無(wú)RNA酶操作原則，防止RNA降解和污染。
2.精確操作：在加樣、離心等步驟中，應(yīng)精確控制體積和時(shí)間，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性。
3.設(shè)備校準(zhǔn)：定期對(duì)熒光定量PCR儀等實(shí)驗(yàn)設(shè)備進(jìn)行校準(zhǔn)和維護(hù)，確保儀器的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。
4.儲(chǔ)存條件：試劑盒和試劑應(yīng)儲(chǔ)存在推薦的溫度下（通常為2-8℃或-20℃），避免光照和反復(fù)凍融。
使用熒光定量RT-PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)需要嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)步驟和注意事項(xiàng)，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
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